PCR聚合酶链反应

    聚合酶链式反应（简称PCR，英文为polymerase chain reaction）是一种基础且广泛应用于DNA突变检测的技术。该方法能够在短时间内将单分子水平的DNA或RNA扩增至数百万倍以上，从而直接分析患者特定基因序列，无需使用克隆、DNA印迹或者RNA印迹分析手段。在检测过程中，仅需极少量的细胞即可进行PCR分析，因此无需从组织样本中提取大量的DNA或RNA模板。PCR的基本机制是通过一对与靶DNA双链序列互补的人工设计的寡核苷酸引物，在耐高温的DNA聚合酶（如Taq酶）的作用下进行扩增反应（详见下图）。通过多次热变性、引物复性和链延伸的循环，靶DNA序列的拷贝数量将以指数级增长，可达到10的6至7次方的数量级。

PCR操作过程分为以下几个步骤：

（1）使用移液器在Eppendorf反应管中加入以下试剂：PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、引物混合液、基因组DNA模板及灭菌双蒸水（ddH2O）。 

（2）将反应管放入PCR仪中，按照设定程序运行：初始95℃变性3分钟（第一轮循环），随后进行每轮的循环程序，包括95℃变性30秒、56℃复性30秒及72℃延伸30秒，最后在72℃条件下延伸10分钟完成最后一轮循环。循环反应通常需进行30个循环，具体复性温度和时间依靶DNA序列长度及引物序列的不同可能有所调整。

（3）反应结束后，取一小部分反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证是否成功扩增到目标PCR产物。同时，通过DNA染色技术，将PCR产物条带的浓度与分子量标记条带进行比较，可粗略估算DNA的浓度。